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酶聯(lián)免疫(HRP)ELISA試劑盒技術(shù)資料
更新時(shí)間:2022-12-08瀏覽:2233次

  酶聯(lián)免疫(HRP)ELISA試劑盒技術(shù)資料

  酶聯(lián)免疫(ELISA)通用試劑盒是一種通用的酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測(cè)抗原或抗體的試劑盒,含有 ELISA 實(shí)驗(yàn)所必須的通用試劑組份,對(duì)反應(yīng)條件、操作步驟、各試劑的濃度進(jìn)行了優(yōu)化,保證了檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和重復(fù)性。

  蛋白檢測(cè)酶標(biāo)試劑盒可用于檢測(cè)小鼠、兔或人的抗體。適用于初次接觸 ELISA 技術(shù)的實(shí)驗(yàn)者,或者為節(jié)省時(shí)間并保證檢測(cè)結(jié)果具有高靈敏和可重復(fù)性的科研工作者。

  1.試劑盒組分

  1.1. 包被緩沖液(10×濃縮) 25ml ×1 瓶

  1.2. BSA 稀釋液/封閉液(10×濃縮) 100ml ×1 瓶

  1.3. 洗滌緩沖液((20×濃縮)100ml ×1 瓶

  1.4. TMB 顯色液 100ml ×2 瓶

  1.5. 終止液(10×濃縮) 25ml ×1 瓶

  1.6. HRP 標(biāo)記抗體:1ml

  1.6.1 HRP 標(biāo)記抗人 IgG (H+L) 0.1 mg

  1.6.2 HRP 標(biāo)記抗兔 IgG (H+L) 0.1 mg

  1.6.3 HRP 標(biāo)記抗鼠 IgG (H+L) 0.1 mg

  儲(chǔ)存在 2~8°C,有效期 2 年,可以完成 20 塊 96 孔酶標(biāo)板檢測(cè)。

  2.試劑盒不提供的試劑或耗材

  2.1. 人、小鼠或兔的一抗

  2.2. 親和層析純化的未標(biāo)記捕獲抗體

  2.3. 酶標(biāo)板(不建議用組織培養(yǎng)板)

  2.4. 吸水紙、毛巾或棉布

  2.5. 蒸餾水或純化水

  2.5. 移液器試劑瓶等

  2.6. 多通道排槍和加液槽

  2.7. 手套

  2.8. 槍頭

  3.檢測(cè)原理

  3.1 雜交瘤篩選可以檢測(cè)雜交瘤培養(yǎng)液中的特異性抗體,使用適當(dāng)標(biāo)記二抗,可以檢測(cè)抗原特異性的人、鼠和兔抗體。

  3.2 檢測(cè)抗原或抗體

  3.2.1 直接 ELISA:是檢測(cè)抗原的簡(jiǎn)單方法,包被抗原,加標(biāo)記的檢測(cè)抗體。

  3.2.2 間接抗體 ELISA: 可以檢測(cè)抗原或抗體,取決于哪種是未知的。包被抗原,加一抗或含抗體的血清或腹水,常用于檢測(cè)動(dòng)物特異性抗體的水平,也可用于檢測(cè)雜交瘤培養(yǎng)上清中的單克隆抗體。

  3.2.3 雙抗體夾心法:是檢測(cè)抗原的一種高度敏感性的方法。用高度純化的抗體分別作為包被抗體和檢測(cè)抗體,檢測(cè)抗體可直接標(biāo)記酶,如果包被抗體和檢測(cè)抗體不是來源同種動(dòng)物,檢測(cè)抗體也可不標(biāo)記,而加針對(duì)檢測(cè)抗體動(dòng)物種屬的酶標(biāo)二抗,此法適用于抗原濃度過低,不能直接包被到酶標(biāo)板上或者含有未知成分干擾的抗原檢測(cè)。

  4.確定反應(yīng)條件

  4.1 雜交瘤篩選

  用間接 ELISA 方法篩選抗體

  4.2 檢測(cè)抗原或抗體

  按照推薦的方法和步驟可以滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的要求,反應(yīng)時(shí)間、溫度和試劑濃度等可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行調(diào)整每一步都應(yīng)該進(jìn)行系統(tǒng)性評(píng)價(jià)以便獲得最佳的實(shí)驗(yàn)條件。試劑通過倍比稀釋以確定最佳濃度。選擇合適的對(duì)照,以確定實(shí)驗(yàn)中存在的問題,發(fā)現(xiàn)引起錯(cuò)誤結(jié)果和高本底的原因。確定實(shí)驗(yàn)方案和樣品數(shù)量后,可以準(zhǔn)備所需要的各種材料和試劑。實(shí)驗(yàn)前,建議所有的試劑恢復(fù)到室溫并混勻。4.3 檢測(cè)條件概述

  4.3.1 包被酶標(biāo)板

  多種包被條件:抗原或抗體濃度、pH、離子強(qiáng)度、溫度和孵育時(shí)間都影響包被效率。此外,結(jié)合蛋白的數(shù)量與分子量成反比。試劑盒中包被液為優(yōu)化的磷酸鹽緩沖液,適用于大多數(shù)抗原和抗體的包被。微孔板應(yīng)選擇專用于 ELISA 的酶標(biāo)板,不建議使用組織培養(yǎng)板。

  包被時(shí),抗原或抗體在包被緩沖液中稀釋后加入到酶標(biāo)板中室溫孵育,盡可能使用最純的抗原或抗體。一般來說 1~10μg/ml 室溫 1 小時(shí)能夠包被飽和。為方便,2~8°C過夜可以到滿意的包被效果。包被后,酶標(biāo)板用 BSA 稀釋/封閉液封閉 5 分鐘,稀釋/封閉液中含 1%BSA,能夠通過封閉未反應(yīng)部位減少非特異性結(jié)合并保護(hù)包被上的蛋白質(zhì)活性。如果暫時(shí)不繼續(xù)實(shí)驗(yàn),可以用塑料膜覆蓋酶標(biāo)板后冷藏保存,需要時(shí)再恢復(fù)室溫繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

  4.3.2 洗板

  加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體后需要洗滌,通過洗滌可以去掉未反應(yīng)試劑幫助降低本底。滿意的洗滌方法是孔與孔之見均勻一致并且沒有液體的相互污染。洗滌時(shí)將板子翻轉(zhuǎn)并將液體甩掉拍凈。洗滌液中含有 0.05%吐溫-20 以抑制非特異性結(jié)合。如果實(shí)驗(yàn)過程中斷,應(yīng)該將酶標(biāo)板中加入洗滌液以避免酶標(biāo)板干燥。

  4.3.3HRP 標(biāo)記抗體

  HRP 標(biāo)記的抗體作為檢測(cè)抗體,與底物反應(yīng)后,使底物顯色。實(shí)驗(yàn)過程中避免接觸疊氮na,疊氮na可使 HRP 失活。

  4.3.4 底物

  使用 TMB 底物,一般來說,產(chǎn)生的顏色與待測(cè)物呈正比。

  4.3.5 對(duì)照和標(biāo)本

  每次實(shí)驗(yàn)都要包含適當(dāng)?shù)膶?duì)照以用于分析檢測(cè)體系的效能。定量 ELISA 要以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較。每次實(shí)驗(yàn)要設(shè)以下對(duì)照:

  4.3.6 本底對(duì)照:不加標(biāo)本,其它試劑都加,可以幫助分析非特異性本底的原因。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果減去本底以保證實(shí)驗(yàn)之間的可比性。

  4.3.7 陰性對(duì)照:加已知的陰性參考品。

  4.3.8 閾值對(duì)照:加弱陽(yáng)性參考品用于確定陽(yáng)性的臨界值。

  4.3.9 陽(yáng)性對(duì)照:加強(qiáng)陽(yáng)性參考品以確定最大線性信號(hào)。

  對(duì)照和標(biāo)本都用 BSA 稀釋/封閉液進(jìn)行稀釋以保證本底,所有實(shí)驗(yàn)最好做雙份。

  5.試劑配制

  所有試劑當(dāng)日配制

  5.1 1X 包被液:用蒸餾水稀釋濃縮洗滌液(1ml 濃縮包被液+9ml 蒸餾水)

  注意:如果在 10X 中出現(xiàn)結(jié)晶,加熱到室溫或 37°C混勻并再溶解。

  5.2 1X BSA 稀釋/封閉液:

  雜交瘤篩選:稀釋濃縮 BSA 稀釋/封閉液(2ml 濃縮 BSA 稀釋/封閉液+8ml 蒸餾水)

  其它檢測(cè):稀釋濃縮 BSA 稀釋/封閉液(5ml 濃縮 BSA 稀釋/封閉液+45ml 蒸餾水)

  注意:如果在 10X 中出現(xiàn)結(jié)晶,加熱到室溫或 37°C混勻并再溶解。

  5.3 1X 洗滌液:

  濃縮洗滌液 20 倍稀釋(15ml 濃縮洗滌液+285ml 蒸餾水)。稀釋的洗滌液室溫穩(wěn)定至少

  6 個(gè)月。

  5.4 二抗工作液:

  二抗?jié)饪s液濃度為 0.1mg/ml,2~8°C穩(wěn)定至少 1 年,使用前用 1X BSA 稀釋/封閉液稀釋,對(duì)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)而言,0.1~2.0μg/ml 工作濃度。

  5.5 TMB 顯色液:直接使用。

  5.6 終止液:直接使用

  5.7 標(biāo)本:

  5.8 對(duì)照

  6.實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

  通過 3 個(gè)變量來優(yōu)化 ELISA 條件: 試劑濃度、溫度、孵育時(shí)間。一般情況下,室溫反應(yīng)對(duì)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虻玫胶芎玫慕Y(jié)果。

  優(yōu)化不同試劑濃度和不同孵育時(shí)間,選擇最佳的實(shí)驗(yàn)條件。在優(yōu)化最佳濃度時(shí),第一個(gè)試劑倍比稀釋,然后第二個(gè)試劑倍比稀釋,每一孔都對(duì)應(yīng)于第一個(gè)試劑和第二個(gè)試劑的某一個(gè)稀釋度的組合。棋盤滴定確定試劑的最佳濃度

  1.加 100μl 稀釋液到 2~12 列的每孔。

  2.加 200μl 稀釋的試劑到第一列的每孔中。

  3.從第 1 列的孔中取 100μl 轉(zhuǎn)移到第二孔中,混勻用槍吹吸 3~5 次。

  4. 重復(fù)步驟 3 向后稀釋,一直到第 11 列,吸取第 11 列 100μl 棄去, 第 12 列作為對(duì)照。

  重復(fù)以上的操作,從 A 排至 G 排, 稀釋第二個(gè)試劑,H 排作為對(duì)照。

  7.操作步驟

  7.1 雜交瘤篩選

  包被液:在 1×包被液中稀釋抗原至合適的濃度(一般 1~10μg/ml)。

  一抗工作液:含有單克隆抗體的培養(yǎng)液。

  二抗工作液:取 25μl 的酶標(biāo)二抗稀釋到 5.0 ml 1X BSA 的稀釋/封閉液中

  7.1.1 包被抗原

  1. 加抗原到酶標(biāo)板中。

  2. 室溫孵育 1 小時(shí)。

  3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

  7.1.2 封閉酶標(biāo)板

  1.加 150 uL 1X BSA 稀釋/封閉液到每孔中。

  2. 孵育 5-15 分鐘, 甩掉板中液體并拍凈殘液。

  7.1.3 與含單克隆抗體的培養(yǎng)液反應(yīng)

  1.每孔中加 50 uL 含單克隆抗體的培養(yǎng)液。

  2. 室溫反應(yīng) 1 小時(shí).

  3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

  7.1.4 洗板

  1. 加入 1X 洗滌液。

  2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

  3. 重復(fù) 3~5 次。

  7.1.5 加二抗

  1. 每孔加 50 uL 二抗。

  2. 室溫反應(yīng) 1 小時(shí)。e.

  3. 甩掉板中液體并拍凈殘液,洗板。

  4. 最后一次浸在洗滌液中 5 分鐘,甩掉板中液體并拍凈殘液。

  7.1.6 顯色反應(yīng)

  1. 每孔加 50 uL 底物,室溫反應(yīng) 15 分鐘。

  2. 每孔加 50ul 終止液。

  3. 測(cè) OD 值,檢測(cè)波長(zhǎng) 450nm。

  7.2 直接 ELISA

  抗原包被液:將抗原稀釋在 1X 包被液中,濃度 1~10μg/ml。

  酶標(biāo)抗體:稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中,稀釋度參考條件優(yōu)化方法。

  7.2.1 加抗原

  1. 在酶標(biāo)板中每孔加入 100μ抗原包被液。

  2.室溫孵育 1 小時(shí)。

  3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

  7.2.2 封閉

  1. 每孔加 300μ1X BSA 稀釋/封閉液。

  2. 反應(yīng) 5 分鐘,甩掉板中液體并拍凈殘液。

  7.2.3 加酶標(biāo)抗體

  1. 每孔加入 100 μl 酶標(biāo)抗體。

  2. 室溫孵育 1 小時(shí)。

  3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

  7.2.4 洗板

  1. 加入 1X 洗滌液。

  2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

  3. 重復(fù) 3~5 次。

  4. 最后一次浸在洗滌液中 5 分鐘,甩掉板中液體并拍凈殘液。

  7.2.5 顯色反應(yīng)

  1. 每孔加 50 uL 底物,室溫反應(yīng) 15 分鐘。

  2. 每孔加 50ul 終止液。

  3. 測(cè) OD 值,檢測(cè)波長(zhǎng) 450nm。

  7.3 間接抗體 ELISA

  抗原包被液:將抗原稀釋在 1X 包被液中,濃度 1~10μg/ml。

  一抗/二抗工作液:將抗體稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中,稀釋度參考條件優(yōu)化方法。

  7.3.1 加抗原

  1. 在酶標(biāo)板中每孔加入 100μ抗原包被液。

  2.室溫孵育 1 小時(shí)。

  3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

  7.3.2 封閉

  1. 每孔加 300μl 1X BSA 稀釋/封閉液。

  2. 反應(yīng) 5~15 分鐘,甩掉板中液體并拍凈殘液。

  7.3.3 加一抗

  1. 每孔中加入 100μl 一抗

  2. 室溫反應(yīng) 1 小時(shí)

  3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

  7.3.4 洗板

  1. 加入 1X 洗滌液。

  2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

  3. 重復(fù) 3~5 次。

  7.3.5 加二抗

  1. 每孔加入 100μl 酶標(biāo)二抗。

  2. 室溫孵育 1 小時(shí)。

  3. 重復(fù) 3~5 次。

  4. 最后一次浸在洗滌液中 5 分鐘,甩掉板中液體并拍凈殘液。

  7.3.6 顯色反應(yīng)

  1. 每孔加 100 uL 底物,室溫反應(yīng) 15 分鐘。

  2. 每孔加 100ul 終止液。

  3. 測(cè) OD 值,檢測(cè)波長(zhǎng) 450nm。

  7.4 雙抗體夾心 ELISA

  包被液:將抗原稀釋在 1X 包被液中,濃度 1~10μg/ml。

  抗原標(biāo)本:將抗原標(biāo)本稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中。

  二抗工作液:將抗體稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中,稀釋度參考條件優(yōu)化方法。

  7.4.1 加捕獲抗體

  1. 在酶標(biāo)板中每孔加入 100μ抗體包被液。

  2.室溫孵育 1 小時(shí)。

  3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

  7.4.2 封閉

  1. 每孔加 300μl 1X BSA 稀釋/封閉液。

  2. 反應(yīng) 5~15 分鐘,甩掉板中液體并拍凈殘液。

  7.4.3 加抗原

  1. 每孔中加入 100μl 標(biāo)本液

  2. 室溫反應(yīng) 1 小時(shí)直至過夜。

  3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

  7.4.4 洗板

  1. 加入 1X 洗滌液。

  2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

  3. 重復(fù) 3~5 次。

  7.4.5 加標(biāo)記抗體1. 每孔加入 100μl 標(biāo)記。

  2. 室溫孵育 1 小時(shí)。

  3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

  4. 重復(fù) 3~5 次。

  5. 最后一次浸在洗滌液中 5 分鐘,甩掉板中液體并拍凈殘液。

  7.4.6 顯色反應(yīng)

  1. 每孔加 100 uL 底物,室溫反應(yīng) 15 分鐘。

  2. 每孔加 100ul 終止液。

  3. 測(cè) OD 值,檢測(cè)波長(zhǎng) 450nm。

  8.可能出現(xiàn)的問題和解決辦法

  8.1 以下結(jié)果表示實(shí)驗(yàn)有效:

  陰性對(duì)照:無(wú)色

  背景對(duì)照:OD 值低于 0.2

  閾值對(duì)照:中度顯色

  強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照:深度顯色,OD≥1.0

  8.2 希望增加特異性信號(hào)

  1. 增加酶標(biāo)抗體的濃度或延長(zhǎng)孵育時(shí)間或提高孵育溫度。

  2. 延長(zhǎng)底物的孵育時(shí)間。

  3. 增加包被抗原濃度或延長(zhǎng)孵育時(shí)間。

  4.用純化的抗原。

  5. 封閉時(shí)間縮短或增加 BSA 稀釋/封閉液的稀釋度。

  6. 減少洗板次數(shù)或操作更輕柔。

  8.3 減少非特異性信號(hào)

  1.減少包被抗原濃度或縮短孵育時(shí)間。

  2.減少酶標(biāo)抗體的濃度或縮短孵育時(shí)間或降低孵育溫度。

  3.縮短底物的孵育時(shí)間。

  4.增加洗板次數(shù)或延長(zhǎng)洗滌液浸泡時(shí)間。

  5.通過加低濃度包被抗原或捕獲抗體到稀釋的酶標(biāo)物中以減少結(jié)合物的交叉反應(yīng)。

  8.4. 背景忽高忽低,檢查洗板機(jī)功能是否正常。


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