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　　實驗原理：做ELISA實驗時如何操作?
 

　　ELISA實驗原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合，此種結合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。

　　酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色氧化型，出現(xiàn)顏色反應。

　　因此，可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過ELISA檢測儀進行定量測定，這樣就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。

　　ELISA實驗步驟及注意事項:

　　1、固相載體選擇

　　聚苯乙x：具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。

　　聚氯乙x：聚氯乙x對蛋白質的吸附性能比聚苯乙x高，但空白值也略高。

　　良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。

　　2、包被

　?、侔蹇椎倪x擇：ELISA別的微孔板。

　?、诳贵w選擇：選擇支持ELISA實驗的抗體，根據(jù)推薦濃度稀釋或摸索適濃度。

　?、郯?strong>緩沖液：pH9.6碳酸鹽緩沖液或pH7.2磷酸鹽緩沖液。

　?、馨粶囟龋?-8 ℃過夜包被或室溫(37℃)包被2h。

　　⑤包被濃度：包被濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化。一般包被濃度為10ug/ml-20ug/ml。

　　3、封閉

　　①包被之后一定要立即封閉(封閉非特異性抗體)。

　?、谶x擇效果較好的封閉劑(細胞培養(yǎng)BSA、Tween等)。

　　4、加樣及孵育

　?、偌訕訒r應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

　　②孵育的時間及溫度參考試劑盒說明書。如有條件，建議加樣孵育時使用shaker震蕩儀，推薦軌道直徑3mm，轉速在500±50rpm。

　　③檢測抗體、酶標物的稀釋比例、孵育溫度、孵育時間嚴格根據(jù)說明書提示。

　　④洗板對于ELISA來說，是其關鍵的一步，保證ELISA的特異性。

　　⑤封板膜一定要一次一換，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。

　　5、顯色和終止

　?、偈褂眯铏z查，底物在加入96孔板之應為無色透明。

　?、陲@色底物需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免污染。

　?、鄯跤龝r間，說明書上為參考范圍，具體需要根據(jù)實驗條件自行摸索?？蓞⒖紭饲鷿舛却罂椎念伾?yōu)樗{色較明顯時即可。

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