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ELISA實驗:哪些因素會導致ELISA實驗的假陽性
更新時間:2023-08-24瀏覽:830次

  ELISA實驗:哪些因素會導致ELISA實驗的假陽性


  ELISA法對IgG、IgM都有很好的檢測能力,因其靈敏度高,價格低廉,操作方便,結果客觀,在實驗室廣泛應用,但在工作中遇到的zui大的問題是出現(xiàn)假陽性的問題。影響因素除了方法學、試劑盒本身之外,還有標本處理、操作不當?shù)榷喾N因素,雙試劑兩組結果進行配對t檢驗,差異(P>0.05)均無統(tǒng)計學意義。

  多種因素可能會導致ELISA法本底偏高。出現(xiàn)灰值,除了嚴格操作、做好質(zhì)控外,對可疑假陽性的標本一定要認真復測。為避免假陽性結果的出現(xiàn)現(xiàn)將產(chǎn)生假陽性的原因分析如下:

  1、內(nèi)源性因素

  (1)年齡因素

  老年人容易出現(xiàn)免疫功能異常,產(chǎn)生一些異常蛋白質(zhì)干擾了檢測的結果出現(xiàn)假陽性。

  (2)疾病因素

  類風濕關節(jié)炎、紅斑狼瘡、糖尿病、自身免疫性疾病等可使患者體內(nèi)含有嗜異性抗體,自身抗體、類風濕因子等,這些特殊成分在反應過程中有一定的吸附作用,多為體內(nèi)某些抗原物質(zhì)干擾所致產(chǎn)生假的顯色反應而出現(xiàn)假陽性。


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  2、標本因素

  (1)標本處理不chedi

  血液抽出后未wan全凝固而離心分離血清不能使纖維蛋白原wan全析出,加樣后板孔中形成纖維蛋白薄膜或絮狀物,造成洗板不che底干凈,酶殘留在反應孔中,使反應孔吸光度值偏高,出現(xiàn)假陽性,待測血清中混有纖維蛋白原,這種物質(zhì)易沉淀或附著在聚乙烯空內(nèi)不易洗凈,試驗表明在較高的離心轉(zhuǎn)速(3000/min)和較長的離心時間(>10/min)之上,血液標本被充分地離心分離后,使紅細胞和纖維蛋白充分沉淀,可以在加樣時避免加入這兩種干擾物質(zhì)對試驗結果的影響。

  (2)標本溶血

  標本溶血時細胞內(nèi)液的各種活性酶以及具有酶活性的物質(zhì)與底物非特異性結合,洗滌時不易洗去,催化底物產(chǎn)生一定的顯色反應,使本底吸光度值偏高形成假陽性。

  (3)細菌污染

  標本放置、處置不當被細菌污染,一些細菌體內(nèi)可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶會對相應的酶做標記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾,造成弱的假陽性反應。

  3、操作因素

  聚苯乙烯因其具有較長的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于ELISA試驗的固相載體,聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,因此需要通過洗滌清楚在反應過程中,非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì),洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟,但卻決定著試驗的成敗,可以在加樣前離心時得以控制,BUNSEN本生試劑盒 同樣也可以通過適當增加洗滌的次數(shù)和浸泡時間減輕或避免對試驗結果的影響,同樣對于血液存在的非特異性的lgG的樣本很難在加樣時將其去除,那么解決的時機就是洗滌過程。

  (1)加樣太快,加樣時加在孔壁上或有氣泡。

  (2)底物液反復使用被污染或被強光照射時間過長。

  (3)板要平整,尤其是在洗板機洗板的過程中,往往是3排一起洗,如果板不平,就很可能造成洗液有殘留,從而導致非特異性結合不能清除干凈,對實驗結果造成干擾。

  (4)洗液溫度 實驗表明:洗液溫度也會影響洗板的干凈程度,尤其是冬天溫度過低時容易出現(xiàn)“花板"問題,因此,需保持在室溫在20-30℃。

  洗液未注滿孔,孔壁洗滌不干凈也易造成假陽性現(xiàn)象。

  (5)洗液要新鮮配置,洗液要臨用前新鮮配置,放置時間過長易產(chǎn)生絮狀物或渾濁,造成賭孔導致假陽性。

  洗板次數(shù)不夠或洗滌間隔時間過短也會造成由于洗板不凈而造成假陽性,孵育時間過長也會造成假陽性;由于樣本較多,加樣后未及時放入孵育箱,反應板在室溫呆的時間過長,既間接增加了孵育時間,導致孵育時間過長。

  4、儀器因素

  (1)酶標儀是垂直對反應孔比色,反應孔底部污染時,出現(xiàn)反應孔吸光度值偏高。

  (2)洗板拖尾現(xiàn)象,洗板機在洗板過程中,出水針出水不暢,滴滴答答不間斷出現(xiàn)水滴,造成板上水過多,拍板不干凈。

  5、方法學因素

  (1)廠家試劑盒,BUNSEN本生試劑盒 由于不同廠家的診斷試劑所包被的抗原配比以及抗原純度不盡一致,造成靈敏度和特異性不同,因此也造成了假陽性的產(chǎn)生。三代免疫試劑盒只檢測抗體,被某些身體不明抗原干擾,導致的假陽性。

  (2)實驗灰區(qū),在陽性與陰性之間有一條明顯的分界線,作為陽性判定值(cutoff)來判定結果,一般把檢測值S/COV值在0.6-1范圍內(nèi)時作為灰區(qū)帶,因此當1

  (3)“鉤狀效應"的產(chǎn)生,需對標本進行稀釋重復檢測。

  (4)酶標儀的波長選擇,建議酶標儀比色時選擇雙波長,即敏感波長(主波長)和非敏感干擾波長(次波長),zui后從儀器上得到的讀數(shù)為敏感波長與非敏感干擾波長之差,排除(板孔的劃痕、污跡)干擾。

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