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ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想、應(yīng)注意哪些要點(diǎn)
更新時(shí)間:2024-01-15瀏覽:568次

  ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想、應(yīng)注意哪些要點(diǎn)


  優(yōu)化ELISA的重點(diǎn)之一在于洗滌。洗滌步驟可降低未結(jié)合抗體所引起的背景信號(hào),從而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保只有特異的結(jié)合事件被保留,在最后一步產(chǎn)生信號(hào)。而不充分的洗滌會(huì)導(dǎo)致差異和高背景,從而帶來不理想的結(jié)果。

  在做ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí),洗板有兩種方法:手工法洗板 和 洗板機(jī)洗板。二者沒有本質(zhì)的差別,只要操作合乎要求,均能得到正確、可靠的結(jié)果。

  手工洗板:

  手工洗板人為因素比較大,實(shí)驗(yàn)人員必須經(jīng)驗(yàn)豐富,洗滌次數(shù)要足夠,沖擊力又不要太大,加入的洗液量以說明書為準(zhǔn),防止孔口內(nèi)有游離酶未能洗凈,同時(shí)防止孔與孔之間液體交叉。洗滌結(jié)束后扣干亦非常重要,否則易造成假陽性。每次洗完板后,在吸水紙上輕輕拍干,拍板時(shí)要垂直,避免交叉感染。用力不能過猛,防止抗原抗體復(fù)合物脫離;吸水紙要一次性使用,應(yīng)使用不易脫落碎屑的吸水紙為宜。酶結(jié)合物不耐干燥,特別在較高的溫度下更易失活,所以拍干的反應(yīng)板應(yīng)盡量縮短在空氣中暴露的時(shí)間,時(shí)間越長(zhǎng),吸光度值越低。

  手工操作有 浸泡式 和 流水沖洗式 兩種方法:

  浸泡式

  1. 吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液;

  2. 用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后,即甩去);

  3. 浸泡,即將洗滌液注滿板孔,放置1~2分鐘,間歇搖動(dòng),浸泡時(shí)間不可隨意縮短;

  4. 吸干孔內(nèi)液體。吸干應(yīng),可用水泵或真空泵抽吸,也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干;

  5. 重復(fù)操作步驟3和4,洗滌3~4次(或按說明規(guī)定)。在間接法中如本底較高,可增加洗滌次數(shù)或延長(zhǎng)浸泡時(shí)間。

  微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的,非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán),也含親水基團(tuán),其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合,從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合,并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用,使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài),從而脫離固相載體。

  洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,其濃度可在0.05%~0.2%之間,高于0.2%時(shí),可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。


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  流水沖洗式

  流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌,洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時(shí)附接一特殊裝置,使小珠在流水沖擊下不斷地滾動(dòng)淋洗,持續(xù)沖洗2分鐘后,吸干液體,再用蒸餾水浸泡2分鐘,吸干即可。浸泡式猶如盆浴,流水沖洗式則好比淋浴,其洗滌效果更為,且也簡(jiǎn)便、快速。

  已有實(shí)驗(yàn)表明,流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時(shí)設(shè)法加大水流量或加大水壓,讓水流沖擊板孔表面,洗滌效果更佳。

  洗板機(jī)洗板:

  洗板機(jī)洗板人為因素少,速度快,條件恒定,但是使用洗板機(jī)洗板時(shí)應(yīng)注意以下三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。

  洗滌參數(shù)

  主要的參數(shù)是洗滌量。自動(dòng)洗板機(jī)會(huì)分配洗滌液。如果你之前遭遇過高背景,那么不要猶豫,將洗滌量調(diào)為高,最好是比包被體積更高。太少的洗滌液會(huì)讓一部分分析表面洗滌不到,從而明顯增加背景。所有反應(yīng)孔的洗滌量必須相同。

  ELISA試劑盒的使用手冊(cè)中有列出洗滌量。我們建議使用350µl洗滌液進(jìn)行洗滌,以便清潔整個(gè)反應(yīng)孔的壁。一般來說,洗滌量越高,則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。

  洗滌次數(shù)

  影響洗滌效果的主要參數(shù)是洗滌循環(huán)的量。當(dāng)然,洗滌次數(shù)越多,背景越低。然而,太多次的洗滌會(huì)降低信號(hào)強(qiáng)度,使其難以測(cè)定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌三次。不過,一般而言,包被平板需要的洗滌次數(shù)比用戶包被的平板要少。對(duì)于用戶包被的ELISA板,必須優(yōu)化洗滌次數(shù)。

  控制洗滌量和洗滌次數(shù)的另一種方法是加入過量的洗滌液。一般來說,96孔板的每個(gè)孔能容納330至460 µl。不過,有些自動(dòng)化洗板機(jī)可設(shè)置程序,分配遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出這個(gè)量的洗滌液,比如1 ml。它是如何做到的呢?其實(shí)很簡(jiǎn)單,就是在分液的同時(shí)打開吸液功能。換句話說,隨著分液器分配更多的液體,抽吸器也將液體吸出。這種技術(shù)能增加洗滌量,但不會(huì)溢出到其他孔中。

  抽 吸

  還有一些參數(shù)會(huì)影響洗滌步驟的效果。這些參數(shù)包括吸液高度和吸入位置,這兩者都能調(diào)整,以降低背景(殘留量)和差異。

  殘留液體中包含未結(jié)合的抗原或抗體,它們會(huì)增加背景信號(hào)。殘留量越小,殘留液體越少,轉(zhuǎn)移到下一步的干擾液體也就越少。

  吸液高度會(huì)明顯影響殘留量;如果洗滌吸頭與反應(yīng)孔底部的距離稍大,那就會(huì)讓殘留量急劇增加。反之,如果洗滌吸頭壓著反應(yīng)孔底部,那么也會(huì)使吸液效率降低,殘留量增加。

  目前的洗板機(jī)一般使用兩種類型的洗頭:剛性和浮動(dòng)。浮動(dòng)洗頭中的吸頭可在洗滌過程中自由上下移動(dòng),而剛性洗頭則固定在適當(dāng)?shù)奈恢?。使用剛性洗頭的洗滌操作在優(yōu)化起來更為復(fù)雜,因?yàn)槟阈枰浅W屑?xì)地調(diào)整吸液高度。如果你們實(shí)驗(yàn)室使用幾種不同的板,那可能會(huì)很耗時(shí)。在使用浮動(dòng)洗頭時(shí),吸頭會(huì)降到反應(yīng)孔的底部。調(diào)整高度就不是很重要,因此洗頭會(huì)下降到底部。

  抽吸的位置也對(duì)殘留量有著重要影響;如果每個(gè)孔只使用一個(gè)抽吸點(diǎn)(這很常見,因?yàn)楦?,那么抽吸的位置需要優(yōu)化。最佳的位置取決于洗頭的性狀,但它幾乎不在反應(yīng)孔的中間,即使這是所有洗頭最常見的默認(rèn)位置。一般來說,最佳位置在孔中間與孔壁之間的某處。

  反應(yīng)孔的形狀也會(huì)影響殘留量。C形底(平底圓角)的微孔板一般會(huì)比那些平底尖角的微孔板殘留量更低。

  洗板時(shí)注意事項(xiàng):

  1. 需每天校正注液量及殘液量,洗滌后殘液量不得大于2 μl。

  2. 及時(shí)更換破損吸液針,避免破壞底板包被。

  3. 針對(duì)不同廠家酶標(biāo)板注意調(diào)整吸液頭下降高度,避免沖洗針頭卡住酶標(biāo)板。

  4. 注意調(diào)整洗液量,洗液量過多將溢出,過少將達(dá)不到洗滌效果。

  5. 關(guān)機(jī)前使用蒸餾水沖洗管道,避免洗液的結(jié)晶物堵塞管道。

  4. 不同種試劑盒的洗液嚴(yán)禁混合使用。

  為了洗滌效果較好,實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法,在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1~2次,能達(dá)到理想的洗滌效果。ELISA看起來很簡(jiǎn)單,但是在實(shí)際操作過程中,絕不能掉以輕心,除了嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作,高品質(zhì)的試劑盒與專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)也是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的保證!

  ELISA 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命,追求企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的不斷提升。公司在經(jīng)營(yíng)中始終秉承:遵紀(jì)守法,嚴(yán)于律己,寬仁以待,敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn),以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場(chǎng),較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏,是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們?cè)概c您真誠(chéng)合作,共創(chuàng)美好的未來。

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